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熒光-PCR法的相關數據處理常識要弄清

更新時間:2022-10-17點擊次數:747
   實時熒光-PCR法是在DNA擴增反應中,以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應(PCR)循環后產物總量的技術。它通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析。實時熒光定量PCR是在PCR定性技術基礎上發展起來的核酸定量技術。
  對熒光-PCR法的數據處理我們要了解一個關鍵的因素“Ct值”。在實時定量PCR的數據圖中,x-軸表示PCR循環數,y-軸表示擴增反應的熒光值,也就是擴增產物的量。這個圖中有基線、閾值、Ct值這幾個概念,從這幾個值我們能夠最終得到模板中目的基因的含量。
  基線是擴增曲線中的水平部分。在反應初階段,雖然產物是指數級增長,但是由于總量太少,其熒光處于背景水平,檢測不到熒光增加。因此基線信號的產生是由于測量的偶然誤差引起的。然而當累積了足夠的擴增產物,足以產生可檢測的熒光信號時,這個信號的值就被稱為閾值,通常閾值默認為基線信號的標準偏差×10。在閾值的前后,PCR的反應仍然是指數級增長的,因此此時的PCR結果可靠,可以準確地反映體系中模板的初始量。Ct值是信號強度達到閾值時所需要的循環數,也就是擴增曲線與閾值的交叉點。
  為什么知道了Ct值就能夠得到初的目的基因含量呢?
  一個基因的單次反應擴增曲線中要計算擴增產物的分子數N,它等于模板的分子數乘以1+擴增效率的n次方,n代表循環次數。也就是說,如果擴增效率為100%,產物分子數就等于模板數乘以2的n次方。但是顯然,在線性增長期和平臺期,擴增效率不可能是100%,因此上述PCR理論方程只在指數期成立。

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